Иммунология

Прямое окрашивание клеток также служит одним из лучших контролей специфичности антисыворотки. Нередко антисыворот­ки, достаточно специфичные в иммунодиффузии или в реакции гемагглютинации, еще содержат примесные антитела, выявляе­мые в реакции непрямой иммунофлуоресценции или другим, бо­лее чувствительным методом.

Антисыворотки к аллотипам иммуноглобулинов, к антигенам гистосовместимости или к любым другим антигенам внутривидо­вого полиморфизма необходимо тестировать на клетках особей (инбредных линий), заведомо положительных и отрицательных по данному аллоантигену.

С помощью пары антиглобулиновых сывороток, меченных раз­ными флуорохромами, можно проводить двойное окрашивание клеток и выявлять иммуноглобулины разных классов или под­классов. Двойное окрашивание лишь тогда дает надежные и четкие результаты, когда из двух видов молекул разной специ­фичности только один скапливается на одном из полюсов клетки (образование «шапочки», см. разд. III). Известно, что молекулы разных иммуноглобулинов, находясь в одной и той же клетке, пе­редвигаются в плоскости ее мембраны независимо друг от друга (см. Rowe et al., 1973; Knapp et al., 1973). Поэтому скопление

ГСН (Fluka, Букс, Швейцария) и ДЦК (Fluka) хранят при 4°С в виде 1 М основных растворов в ДМФ, ДМСО, диоксане или ТГФ (выбор растворителя определяется либо растворимостью производного карбоновой кислоты, которое нужно этерифициро- вать, либо другими практическими соображениями). Все раство­рители — продукты фирмы Merck (Дармштадт, ФРГ). В раство­ре ДЦК со временем наступает частичная кристаллизация, ко­торой можно пренебречь, если нет значительного уменьшения концентрации вещества.

Гаптены, присоединенные через промежуточную молекулу («спейсер», или «мостик»), по антигенным свойствам могут от* личаться от присоединенных непосредственно (Rehn et al., 1976). Эти различия могут быть обусловлены повышенной свободой взаимодействия антигена с активным центром специфического рецептора или антитела; вероятно, так обстоит дело в случае, ТНФ и ТНФ/АКК; оба гаптена присоединяются, по-видимому, к идентичным аминогруппам и различаются поэтому только доба­вочной 6-углеродной цепью спейсера (Becker, Makela, 1975). Ан­тигенные различия могут объясняться также разными местами присоединения одних и тех же гаптенов, как, например, в случае гаптенизации с помощью солей диазония по сравнению с при­соединением через упомянутую выше и-гидроксифенилуксусную кислоту. И, наконец, возможно изменение «специфичности» при наличии «иммунодоминантного» участка на спейсере. Разумеет­ся, для оценки специфичности антигенного распознавания весьма важно учитывать, с каким из этих факторов мы имеем дело в данном эксперименте.

Гель-хроматография с использованием биогеля Р-300 или се- фадекса G-200 позволяет разделить сыворотку или смесь имму­ноглобулинов по величине белковых молекул. Чаще всего этот метод используют для количественного фракционирования IgM, который можно отделить от IgG и IgA одноэтапной хроматогра­фией. В присутствии концентрированных солей (0,5 М NaCl на 0,02 М фосфатном буфере с рН7,3 или 0,05 М трис-HCl с рН8,0) IgM большинства животных не входят в гель и элюируются в первом пике. При диализе сывороток против буферов с низкой ионной силой многие IgM и макроглобулины Вальденстрёма вы­падают в осадок, так как они являются эуглобулинами. Промы­тый осадок растворяют в забуференном 0,5М NaCl и фракцио­нируют на колонке с сефадексом G-200. Фракции, выходящие в. свободном объеме, содержат IgM. Выделенные таким образом IgM мышей и кроликов часто содержат примесь аг-макроглобу- лина, который элюируется вместе с IgM. С наибольшим успехом примеси можно удалить электрофорезом в агарозном блоке: IgM мигрирует к катоду, а аг-макроглобулин — к аноду (см. разд. V).

Каждый кусочек геля растворяют в 0,5—1,0 мл 30%-ной H202 при 60°С в течение ночи в закрытых сцинтилляционных стакан­чиках. Перед определением радиоактивности в стаканчики добав­ляют по 10 мл сцинтилляционной жидкости (7 частей толуола, содержащие 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л, и 6 частей тритона Х-100).

В другой методике используют растворитель NCS (Amers- ham/Searle Corp., Арлингтон Хейтс, Иллинойс, США), вызываю­щий набухание кусочков геля и диффузию белков в сцинтилля- ционную жидкость (Ames, 1974). К каждому кусочку геля добав­ляют 10 мл сцинтилляционной смеси (143 мл растворителя NCS, 3,73 л толуола, 14 г РРО и 0,21 г РОРОР) и в закрытых стакан­чиках инкубируют в течение ночи при 37°С.

Растворимые полиакриламидные гели можно получать, ис­пользуя вместо Бис этилендиакрилат (ЭДА) (Choules, Zimm, 1965) или Г^Ы’-диаллилтартардиамид (ДАТД) (Anker, 1970). Кусочки геля, приготовленного с ЭДА, растворяют в течение не­скольких часов при комнатной температуре в щелочной среде, на­пример в 0,5—1 мл концентрированного NH4OH, а затем добав­ляют водорастворимую сцинтилляционную жидкость. Гели, при­готовленные с ДАТД, растворяют в 0,5—1 мл 2%-ного раствора йодной кислоты в течение 30 мин при комнатной температуре.